چکیده:
انتقال ژن به واسطه اسپرم می‌تواند یک روش ساده و ارزان برای تولید جانوران تراریخته باشد، اما کارایی این روش هنوز پایین است که می‌تواند به علت ورود مقدار ناکافی DNA خارجی به اسپرم باشد. هدف از این مطالعه بررسی روش‌های تشدید کننده جذب DNA خارجی توسط اسپرم گوسفند مانند لیپوفکشن، انجماد سریع و تیمار با تریتون X100 و DMSO در میزان جذب و تحرک اسپرم‌های دارای جذب بود. در آزمایش اول اسپرم گوسفند با کمپلکسی از مقادیر مختلف پلاسمید نشاندار شده با ماده فلورسنت رودآمین و لیپوفکتامین2000 گرمخانه‌گذاری شدند. در آزمایش دوم اسپرم‌ها با تریتون X100 یا دی متیل سولفوکساید منجمد شدند. نتایج نشان داد که میزان ترانسفکشن در گروه لیپوزوم/DNA 100 نانوگرم کمتر از گروه بدون لیپوزوم بود اما در گروه‌های 300 و600 نانوگرم اختلاف معنی‌داری وجود نداشت. در شدت جذب و تحرک نیز اختلاف معنی‌داری بین گروه‌های مختلف وجود نداشت. همچنین هیچ کدام از اسپرم‌های دارای جذب DNA خارجی، متحرک نبودند. لذا انتقال با واسطه لیپوزم باعث بهبود میزان ترانسفکشن نشد. همه اسپرم‌های تیمار شده با تریتون X100 و منجمد شده پلاسمید نشاندار را به خود جذب کرده بودند اما همه آن‌ها بی حرکت بودند. در اسپرم‌های تیمار شده با دی متیل سولفوکساید با غلظت نهایی 1/0%، میزان جذب نسبت به گروه شاهد به طور معنی‌داری (P<0.05) بیشتر بود (40/69% در مقابل 80/57%). میزان تحرک در گروه تیمار و گروه شاهد اختلاف معنی‌داری نداشت. نتیجه آن که استفاده از لیپوفکتامین نتوانست نه میزان ترانسفکشن را بهبود بخشد و نه اسپرم‌های ترانسفکت شده متحرک تولید کند. اگر تیمارهای تخریب کننده غشاء مثل انجماد و تیمار با تریتون X100 به هسته اسپرم صدمه نزنند، این اسپرم‌ها می‌توانند بدون نیاز به انتخاب جهت تزریق داخل سیتوپلاسمی اُاُسیت استفاده شوند.
چکیده انگلیسی:
Sperm mediated gene transfer can be an inexpensive and simple method in animal transgenesis; however its efficiency is poor, mainly due to the spermatozoa’s lesser uptake of exogenous DNA. In the present study, the effects of lipofection and other augmentation techniques, such as sperm freezing and spermatozoa treatment with triton X100 and DMSO, on exogenous DNA uptake by sheep spermatozoa and motility of sperms with plasmid uptake were evaluated. In the first experiment, ram sperms were incubated with a complex of rhodamine labeled plasmid (p-EGFP) and Lipofectamine 2000TM. In the second, spermatozoa were treated with Triton X-100TM or DMSO or were frozen without cryoprotectant. The results indicated that there was no significant difference (P<0.05) in the transfection rates and in the uptake intensity of lipofected sperms with 300 and 600 ng of plasmid in comparison with control group, i.e. transfected without lipofectamine. Furthermore, lipofection could not improve sperm motility during true plasmid uptake. Almost all of triton X100 treated and frozen-thawed spermatozoa had absorbed foreign DNA, though all were immotile. In spermatozoa treated with 0.1% DMSO, plasmid absorption rate (69.40%) was significantly higher (P<0.05) than untreated spermatozoa (57.80%), but sperm motility was not significantly different from control group. In conclusion, lipofectamine® 2000 could neither improve transfection rate, nor support motility in transfected sperms. The methods inducing membrane disruption like, freeze-thaw and triton X100 treatment, can be used in ICSI-sperm mediated gene transfer without the need for sperm selection, provided that they cause no damage to sperm nucleus.
خبرنامه
برای ثبت نام در خبرنامه و دریافت خبرنامه ایمیل خود را وارد نمایید.
