چکیده:
آسپارتیک پروتئازها گروه نسبتا کوچکی از آنزیمها میباشند که در نماتودهای متفاوتی از جمله آنکوسرکا ولولوس بیان میشوند. در این تحقیق، یک گمانه زنی در مورد تعداد نسخههای ژن مربوط به کلون OV7A در یک گونه نزدیک به آنکوسرکا ولولوس به نام آنکوسرکا گیبسونی صورت میگیرد. این کار به کمک روش بلوتینگ شکافی انجام میشود. کلون OV7A حاوی یک cDNA کد کننده مربوط به دو سوم از کل ناحیه کد شونده پروتیئن آسپارتیک پروتئاز آنکوسرکا ولولوس میباشد. به منظور انجام هیبریداسیون، میزان معینی از رقتهای سریالی مربوط به DNA ژنومی و DNA پلاسمیدی کلون OV7A به موازات یکدیگر بر روی پرده نایلونی بارگذاری گردید. به منظور تهیه جستجوگر نشاندار، cDNA کلون OV7A توسط پرایمر اختصاصی و به کمک روش PCR تکثیر یافت. پس از انجام هیبریداسیون شکافی، شدت رنگ لکههای ایجاد شده مربوط به DNA ژنومی و پلاسمیدی با یکدیگر مقایسه و سپس فراوانی توالیهای مشابه نسبت به cDNA نشاندار محاسبه گردید. به منظور تایید نتایج به دست آمده، تکنیک بلوتیگ سوترن با کمک هضم DNA ژنومی به وسیله تعدادی از آنزیمهای اندونوکلئاز محدودالاثر صورت گرفت. در بلوتینگ سوترن، عمل هیبریداسیون با جستجوگر اولیه نشان داد که در مواردی که توالی اختصاصی شناسایی آنزیمهای اندونوکلئاز در جستجوگر موجود نیست، عمل هیبریداسیون منجر به مشاهد یک باند میگردد. این مطالعه آشکار ساخت که ژنوم آنکوسرکا حاوی یک نسخه از cDNA نشاندار به ازای هر هاپلوئید ژنوم میباشد.
چکیده انگلیسی:
Aspartic proteases are a relatively small group of enzymes which express in various nematodes including Onchocerca volvulus. An estimation of the gene copy number corresponding to the OV7A clone, which contains a cDNA insert encoding approximately two-thirds of the entire coding sequence of aspartic protease of O. volvulus, was made by slot blot analysis in a closely related species O. gibsonigenome. Nylon membrane was loaded with serial dilutions ofgenomic DNA alongside the OV7A plasmid DNA before hybridizing the membrane to that 32 P-labeled cDNA insert. To prepare the initial probe, OV7A cDNA insert was amplified using gene-specific primers. By comparing the signal intensity of slot blot hybridization of known amounts of genomic DNA and plasmid DNA containing the cDNA insert under similar conditions, the abundance of sequence homologues to the 32 P-labeled cDNA insert in the genome was calculated. For confirmation, southern blotanalysis was performed by digesting genomic DNA with a panel of different restriction enzymes. Hybridizing patterns of the same probe revealed a single band except when predicted internal restriction sites were affected. It was confirmed that Onchocerca contains a single copy of the gene corresponding to this cDNA insert per haploid genome.
خبرنامه
برای ثبت نام در خبرنامه و دریافت خبرنامه ایمیل خود را وارد نمایید.